益生肠球菌应用于断奶仔猪的研究进展
现代集约化养殖业极大提高了养殖业的综合管理和生产能力。但集约化养殖方式限制了畜禽接触土壤，不利于动物肠道正常完全菌群的建立，因此，外界环境条件变化时容易导致幼畜(禽)胃肠道微生物菌群失衡，降低对病原菌抵抗力。例如仔猪早期断奶腹泻就是典型的该类引发疾病，已成为困扰我国养猪业的严重问题，仔猪从断奶到肥育前期，断奶腹泻造成的损失占全部的 75%。目前主要的解决办法是改善饲养管理和在日粮中添加饲用抗生素等，但是，长期大量使用的同时，抗生素的弊端也正日益凸现，如造成动物免疫能力的下降，引发二次感染和继发性感染，出现耐药菌株等，使其应用效果越来越不理想,更为严重的是造成畜禽产品中药物残留，直接危害人类健康。2005 年联合国粮农组织 FAO、国际动物卫生组织 OIE 和世界卫生组织 WHO共同提出了“抗性开端”概念来控制兽用药品的使用，现已经进入了后抗生素时代，未来将彻底禁止在动物饲料中使用抗生素以防止对人类产生的巨大危害，其中欧盟于 2006 年在饲料中全面禁用抗生素类产品。
作为抗生素类物质的替代品，能起到生长促进剂作用的饲料添加剂有很多，如益生菌制剂、酸化剂、酶制剂、寡聚糖、植物提取物等。益生菌制剂是通过改善寄主肠道菌群平衡而发挥有益作用的活的微生物制品。益生肠球菌制剂属于乳酸菌，是益生菌制剂的一种，属于肠道共生菌，在很多动物新出生的 2～3d 内占优势地位。益生肠球菌由于它生长速度快，有较好的粘附能力，能产生乳酸及一些抗菌物质被广泛用作益生菌制剂。不同来源的肠球菌都可以产生水杨酸(BLIS)和伏尔加霉素(enterocins)，这两种物质具有较好的抑菌效果。但是益生肠球活菌制剂在加工、运输及保存过程中易失活，在进人人或动物消化道后大多又难以经受低 pH值的胃酸、胆汁酸及胰液等的作用，因此，难以有足够的数量到达或定居于肠道而发挥作用，因此其饲用效果报道不一。本文针对益生菌的发展和肠球菌的益生与应用特点展开论述。
1 益生菌制剂在饲料行业的发展
益生菌和益生菌制剂的发展很快，20 世纪 80 年代初国际市场上只有 26 种医用益生素开始使用，而且主要集中在日本。1991 年，德、英、法和丹麦等国就有 50 多种在市场上销售，范围涉及猪、肉牛、鸡的饲料。我国最早使用的微生态制剂是乳酶生，现已有大量产品投放市场。半个世纪以来，益生菌制剂显示了良好的效果，如乳酸杆菌和双歧杆菌在许多国家首先用于食品及人的保健制品，近年来也被广泛地用于动物。
1989 年美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)和美国饲料管理协会(Association of American Feed Control Officials，AAFCO)公布了可用于饲料中的公认安全 (genera11y recognized as safe，GRAS)的微生物菌种(表 1 略)，其中包括益生肠球菌，年使用 量在 8000t 以上。我国农业部 1999 年第 105 号文件公布允许使用的微生物种类是 12 种(表 2 略)也包括益生肠球菌。目前用于微生态调节剂的菌种主要有乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆 菌、链球菌、芽孢杆菌及某些酵母和真菌。这些微生物可以单个使用，也可以混合使用。
2 益生肠球菌概述
我国农业部规定可用于生产微生态制剂的微生物有 6 种，即乳酸杆菌、乳酸链球菌、粪链球菌(后更名为粪肠球菌)、芽孢杆菌、双歧杆菌和酵母菌。1906 年 Andrew s 和 Horder 第 一次描述并命名从人类粪便中分离到的革兰氏阳性球菌为粪链球菌，肠球菌被划分为 Lancefield D 群，归属于链球菌属(Streptococcus)。近年来随着核酸杂交技术、细胞脂肪酸分析和细胞壁结构分析技术应用于细菌分类，Schleifer 和 Kilpper 等 1984 年首次提出肠球菌不同于链球菌，肠球菌应从链球菌属中脱离开来，形成一个新的肠球菌菌属(Enterococus)，第九版伯杰细菌鉴定手册将 Lancefild D 群的粪链球菌和屎链球菌归为肠球菌菌属的种。目前肠球菌分类超过 30 多种。肠球菌在血琼脂或营养琼脂表面形成圆形、完整的、光滑的菌落，大多数菌株不产生溶血反应，少数产生 α 或 β-溶血反应。肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，细胞呈球形或卵圆形，(0.6～2.0)μm×(0.6～2～5)μm，单个、多数菌种成双或呈短链状排列；在液体培养基中呈成对或短链，一般无芽胞，无荚膜，少数菌种有鞭毛，兼性厌氧。为化能异氧菌，发酵代谢；可发酵的碳水化合物的范围比较广，主要产 L-(十)-乳酸，但不产气，最终 pH 值为 4.2～4.6，营养需要复杂。接触酶为阴性。通常在 10～45℃能生长(最适 37℃)，在 pH 值为 9.6、6.5%氯化钠中和 40%胆盐中也能生长，个别菌种在 50℃时生长快，水解吡咯烷基-b-萘胺。很少还原硝酸盐，通常发酵乳糖、通常为 Lancefield 血清 D 群，大多数肠球菌不产生色素，极少数产黄色色素。广泛出现于自然环境中，特别是脊椎动物的粪便中。DNA 的(G+C)含量为 37%～45%(摩尔分数)。
3 益生肠球菌的应用特性及其作用机理
益生肠球菌作为乳酸菌的一种，通过自身及其代谢产物调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合的稳定。益生肠球菌必须具备某种特性如安全、黏附、竞争排斥、占位和产生抑制物等，才能在微环境中保持优势。
3.1 应用的安全性
肠道菌群可视为生物体的正常的菌群，这些正常菌群直接参与宿主的生理代谢活动，是宿主正常生理活动不可缺少的重要组成部分，其中粪肠球菌是最为常见的菌，占 82%～87%，其次是屎肠球菌，占 8%～16%。内源性肠球菌作为人体内正常菌群之一主要定植于回肠和结肠部，有些菌株可直接参与宿主的物质代谢过程。例如，可直接参与胆固醇的代谢，并对异常代谢进行调整，使之恢复正常。益生菌制剂产品的安全直接体现在菌种的安全性上，许多益生肠球菌和乳酸杆菌一样，因其具有良好的生物安全性，很早就被人们有意无意地在食品、医药和饲料上使用。对肠球菌的应用主要集中于粪肠球菌和屎肠球菌，最早利用粪肠球菌的是日本首先开发出来的，用于治疗各种肠道疾病。日本目前市场上出售的含有粪肠球菌的酸奶制品或药品有清水制药生产的Lascpan、朝日啤酒株式会社生产的新Lacton、若素制药生产的Lebenin、武田制药生产的Biosmin、韩国生产的用于治疗婴幼儿肠道疾病的益生菌制剂“妈咪爱”等。其中有些产品，如“妈咪爱”目前已打入中国市场。在欧洲一些国家如德国和瑞典生产的益生菌制品如Ventrux、Bioflorin、Fio rmil等都含有屎肠球菌，其活菌数一般在 108 ～109 /g。
3.2 生长代谢快，具有较好的黏附力
肠球菌生长代谢快，任晓燕等报道粪肠球菌在培养 6h 后就进入了对数增长期，并持续 到 14h，16h～18h 进入稳定期，18h 后进入衰亡期。能够在胃肠道上皮细胞上粘附，益生菌能粘附在肠道中生长繁殖是发挥作用的基本条件之一，是保证其有效的竞争排斥病原菌的定植，并充分发挥其生物功能的前提。益生屎肠球菌表面由脂磷壁酸(LTA)、完整肽聚糖(WPG)、多糖和表面层蛋白(SLP)构成，这些物质在黏附和定值中起到主要作用。宿主细胞有相应的特异性黏附性受体，黏附作用才会发生。MarciAakova 等从青贮饲料中筛选出肠球菌 EF9296，并证明它对人肠粘膜及犬齿动物肠粘膜都具有较好的粘附力(人类粘膜：5.5 log 10 cfu/m1，犬齿动物肠粘膜：4.7 log 10 cfu/m1)。Laukova 等比较了肠球菌对不同宿主的黏附特性，研究发现粪肠球菌和屎肠球菌对同一宿主的黏附力没有显著性差异，而且肠球菌对不同宿主的黏附力也无显著性差异。Strompfova 等从狗粪便中筛选 40 株肠球菌，实验证明它们对人肠粘膜的的粘附力为 5%～8%，对犬齿动物肠粘膜的粘附力为 4%～11%，粘附力在宿主间无差异。
3.3 产生益生物质
益生肠球菌在体内发酵糖类，产生大量的乙酸和乳酸，使肠道内的 pH 和氧化还原电位值 Eh 下降，肠道处于酸性环境，对于病源性细菌有拮抗作用，从而抑制其增殖。很多年前， 已有很多学者报道肠球菌可以产生细菌素。细菌素(bacteriocin)是由某些细菌利用核糖体合成机制产生的一种具有抗菌作用的蛋白质或多肽类物质。主要通过专一性地吸附到敏感细胞表面的受体上，而后发挥其不同的作用，如形成细胞质膜离子透性通道，引起离子渗漏，造成电子传递体的解偶联，影响 ATP 的合成和某些物质的运输，抑制蛋白质、DNA，RNA 等大分子物质的合成等，最终导致细胞死亡，从而起到消炎、抗菌等作用。Du Toit 等从小型猪粪便中分离出屎肠球菌和粪肠球菌，研究发现粪肠球菌产生的细菌素抑菌范围较窄，主要针对致病型肠球菌，而屎肠球菌产生的细菌素的抑菌范围较宽，除了对致病型肠球菌还对李斯特菌属、梭状芽孢菌属及丙酸杆菌属都具有抑制作用。Kang 等从婴儿粪便中分离出肠球菌 GM-1，它产生了一种类似伏尔加霉素 P 的细菌素，这种细菌素具有较强的热稳定性而且具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑制作用。Strompfova 等从鸡嗉囊中分离出屎肠球菌 EF55，并证明它所产生的细菌素(BLIS)对革兰氏阳性菌具有广泛的抑菌作用，但对革兰氏阴性菌没有抑制作用等。
3.4 降低胆固醇
益生肠球菌能降低高脂血症，被认为是能降低脂肪吸收的肠肝循环，这些菌在肠道中通过氧化，能使分泌到肠道内的饱合胆汁酸脱饱合或使其脱羟基或发生其他变化，促进胆汁中的胆固醇转化为人体不吸收的粪固醇，不能再通过肝肠循环回到肝脏进而降低血液胆固醇水平。日本河谷康雄曾从健康人肠道中分离出一株具有降低胆固醇的菌株，粪肠球菌 AD1001。袁杰利等的毒理学试验结果证明，屎肠球菌 DM891129 菌株属无毒、弱蓄积，无遗传毒性。功效试验表明，高中低剂量组均可降低实验高脂血症大鼠血胆圊醇，从而起到调节血脂作用。
3.5 增强机体免疫作用
益生肠球菌可以作为非特异性免疫调节因子，增强肠道非特异性免疫能力，促进巨噬细胞产生TNF-α和IL-6，激活淋巴细胞，增加血液中免疫蛋白的含量，提高机体抵抗病原菌的能力。Jalil Ben yacoub等在幼狗日粮中添加屎肠球菌SF68，从断奶到 1 岁，研究发现屎肠球菌SF68 可以提高粪中IgA，抗犬瘟热病毒(anti distemper virus，CDV)的IgG和IgA的水平及淋巴细胞的比例。CD4+和CD8+T细胞的数量没有显著性差异，但是成熟B细胞的比例有所增加。 这说明屎肠球菌SF68 可以提高幼狗的免疫力。Benyacoub等研究了七日前口服屎肠球菌SF68对灌服肠贾第虫的小鼠的保护作用，发现口服屎肠球菌SF68 组的小鼠的特异性抗肠贾第虫的IgA和血液IgG的水平及Peyers斑和肾脏中的CD4+T细胞数量显著增加。屎肠球菌SF68 可以增强粘膜免疫和系统免疫。
4 益生肠球菌在断奶仔猪的上应用
仔猪早期断奶给养猪业带来极大的经济效益，但过早断奶极易导致“仔猪早期断奶综合症”，主要表现为断奶后腹泻、水肿病和内毒素休克。断奶后肠道大肠杆菌浓度上升被认为是导致仔猪腹泻的主要原因之一。大量研究表明仔猪断奶后肠道菌群改变明显，总的趋势是大肠杆菌等致病菌浓度上升，乳酸菌等有益菌浓度下降。张振斌等试验结果表明，断奶应激使仔猪胃和空肠内容物 pH 值升高，直肠粪便中大肠杆菌数量增加，乳酸杆菌数量减少，而且空肠内容物 pH 值和直肠粪便中大肠杆菌数量是反映仔猪腹泻的敏感指标。Franklin 报道 24 日龄断奶仔猪在断奶三天后的空肠、回肠和盲肠的大肠杆菌数比断奶前减少(P<0.05)，而乳酸杆菌数增多(P<0.05)。
针对仔猪早期断奶综合症的发病机理和症状，研究者们开始尝试用微生态制剂的原理和方法治疗该种疾病。卞荣星研究表明仔猪的饲料日粮中添加 0.1%粪肠球菌一牛至香精油复合物，可以明显降低仔猪哺乳阶段及断奶后仔猪腹泻的发生率，增加动物的生产性能。Nelson 等报道在断奶仔猪日粮中添加筛选具有一定抗逆性的四种潜在乳酸菌(包括肠球菌)可以增加仔猪采食量，提高日增重及饲料转化率而且可以显著地减少粪便中大肠杆菌的数量 (P<0.05)。JIN研究证明肠球菌能够抑制大肠杆菌 K88ac 和 K88MB 粘附到小肠粘膜上，并 对大肠杆菌 K88ac 的抑制作用具有剂量效应，当活菌数达到 109 时，抑制效率在 90%以上。Strompfova 等给仔猪日粮中添加屎肠球菌 EKl3，研究表明，屎肠球菌 EKl3 可以显著提高血清总蛋白、钙、血红蛋白、红细胞浓度及颗粒细胞吞噬指数，显著降低仔猪粪便中大肠杆菌的数量。但 Broom 等报道在断奶仔猪日粮中添加粪肠球菌对仔猪的日采食量，日增重及饲料转化率等生产性能没有影响，对胃肠道菌落组成也没有影响，但能降低断奶仔猪 20 天血清 IgG 的含量(P<0.1)。Taras 等研究发现肠球菌对断奶仔猪生产性能没有显著的增加，但有提高饲料转化率的趋势，而且可以减少潜在致病型大肠杆菌的量，进而减少仔猪腹泻发生率。Pollmann 等报道屎肠球菌可以减少衣原体专性细胞病毒浸染仔猪发生率。
5 益生肠球菌存在的问题及发展前景
益生肠球菌具有无毒副作用、促进动物生长、提高饲料转化率、可替代抗生素等优点。但由于存在菌种的筛选、活菌数、菌种的失活、杂菌含量的多少、使用条件等问题而导致益生肠球菌制剂活性降低，出现使用效果的重复性和稳定性较差等。
为了提高益生菌制剂的活性和效力，人们不断的展开了新菌种的筛选和新剂型的研制工作。微胶囊技术就是其中发展较为迅速、应用较为广泛的一种。微胶囊是指利用天然或合成的高分子材料对固体、液体或气体进行包封，粒径为 5～1000μm 的中空胶囊，制备微胶囊的过程称为微胶囊化。包封用的壁壳称为壁材，被包的囊芯称为芯材，芯材可以是单一的，也可以是复合的。囊壁厚度一般为 0.1～200μm 之间，微胶囊的粒子大小，因制备工艺及途不同而不同。常用制备微胶囊的方法有：相分离法、界面聚合法、喷雾冷却和喷雾干燥法、挤压法、双重乳状液法。目前，国外已有此类产品进入到我国的市场上，如瑞士的粪链球菌微胶囊“赐美健”、荷兰的“百福菌”等，但是价格很高，难以大规模使用。
因此，研究对益生肠球菌等低抗逆性微生物进行微胶囊化包被，并提供一条适用的工业化途径，使其稳定性增强，贮存期延长，并可以与其它饲料原料共存、共用，将对微生态制剂在我国饲料行业的广泛应用产生重大的意义。 因此，建议今后有关益生肠球菌添加剂的研究和开发应该加强以下几方面的工作：从细胞水分和分子水平深入研究益生肠球菌的作用机理；加强益生肠球菌新剂型的开发，提高其稳定性和有效性；规范产品标准及检测手段。
注：给牲畜饲料中添加抗生素会引发牲畜的抗微生物抗性，消费者在食用了这些牲畜制成的肉制品和乳制品后也会受到其抗微生物抗性的影响，为了加强管理，全球三大国际性食品健康机构日前正在计划出台一项全球性的法规。联合国粮农组织 FAO、国际动物卫生组织 OIE 和世界卫生组织 WHO 共同提出了上述建议。他们提出了使用兽用药品的风险评估发展阶段，引用了“抗性开端”概念来对药品使用过量进行控制。三大组织还提出应该建立抗生素等级分类，应该彻底禁止对动物使用抗生素，以防止对人类产生巨大危害。
（本文仅供学习参考使用）
